将固氮酶系统导入植物细胞以实现农作物自主固氮，从而减少或替代工业氮肥在农业生产中的应用是生物固氮研究的终极目标。2023年8月16日，北京大学杨建国与王忆平团队在美国科学院院刊《PNAS》上以Article的形式在线发表了题为“Organelle-dependent polyprotein designs enable stoichiometric expression of nitrogen fixation components targeted to mitochondria”的研究论文，创制了基于线粒体信号肽酶的多聚蛋白型固氮酶系统，进一步解决了真核细胞中协调表达固氮酶组分时面临的瓶颈问题。

     固氮酶系统高度复杂，需要十几个基因同时且按特定比例表达才能实现其功能性，基因数量众多及各基因协调表的需求极大的限制了固氮酶系统向真核细胞的转移。为了解决多基因协调表达的问题，2018年杨建国与王忆平团队借鉴了植物病毒多聚蛋白的策略，利用烟草蚀刻病毒的TEVp蛋白酶，在大肠杆菌底盘中成功将产酸克雷伯菌的钼铁固氮酶系统转化为了仅包含5个基因的多聚蛋白型系统（Yang et al., 2018 PNAS）。然而将该系统引入酵母细胞底盘时，发现并不能成功的表达固氮酶的各个组分，通过分析发现外源蛋白酶TEVp与固氮酶组分共表达时可能对酵母细胞产生了潜在的细胞毒性。为了解决这一新的问题，本研究中选择了真核细胞中内源且高度保守的线粒体信号肽酶MPP来替代外源蛋白酶TEVp，从而规避细胞毒性风险。通过设计和筛选获得了一组可以被MPP高效识别和切割的仅包含10个氨基酸残基的序列，基于该序列以及内源MPP构建了2.0版本的多聚蛋白，并成功在酵母线粒体中实现了固氮酶组分的高效和协调表达。

附图：线粒体中多聚蛋白型固氮酶系统示意图

     杨建国研究员与王忆平教授团队长期致力于生物固氮的合成生物学研究，在固氮酶系统的简化方面取得了多项研究成果，为推进真核固氮领域的发展做出了重要的贡献。本论文是研究团队在PNAS发表的第5篇系列研究论文，杨建国研究员为本论文共同第一作者及共同通讯作者；相楠博士为论文共同第一作者；英国JIC研究中心Ray Dixon教授、北京大学生命科学学院王忆平教授为论文共同通讯作者；博士生刘逸珩、郭琛月、李晨昱、蔡舒怡以及博士后李辉参与了部分研究工作。该研究得到了科技部国家重点研发计划项目、国家自然科学基金项目、北京大学生科启东创新基金以及蛋白质与植物基因研究国家重点实验室的资助。

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参考文献：

1. Jianguo Yang#, Xiaqing Xie#, Nan Xiang, Zhe-Xian Tian, Ray Dixon*, and Yi-Ping Wang*. (2018) Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. PNAS. 115 (36): E8509-E8517

2. Jianguo Yang#,*, Nan Xiang#, Yiheng Liu, Chenyue Guo, Chenyu Li, Hui Li, Shuyi Cai, Ray Dixon*, Yi-Ping Wang*. (2023) Organelle-dependent polyprotein designs enable stoichiometric expression of nitrogen fixation components targeted to mitochondria. PNAS. 120 (33): e2305142120

原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2305142120